怎么讓ELISA體系更加安穩(wěn)，以下重點(diǎn)內(nèi)容標(biāo)記：
1.包被原的性質(zhì)很重要：蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不能夠被其辨認(rèn)，所以保存抗原很重要，有的包被原可能不是蛋白，關(guān)于生物素和脂類(lèi)物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事前對(duì)其改造再加以包被，具體方法如下：
①親和素生物素:先親和素先包被載體，參加生物素化的DNA，這種包被方法均勻、結(jié)實(shí)，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。
②脂類(lèi)物質(zhì):可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后參加ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱guo ye或冷風(fēng)吹干，待酒精蒸發(fā)后，讓脂質(zhì)天然干固在固相外表。
③小分子有必要依托和大的蛋白載體偶聯(lián)后才干固定在固相載體上。
2.包被液的挑選：一般挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時(shí)由于實(shí)驗(yàn)的需要，包被原的特殊性也可能選用中性的緩沖溶液來(lái)包。應(yīng)留意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體外表的疏水基團(tuán)間的效果，這種物理吸附對(duì)錯(cuò)特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)一般含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體外表。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)還要有鞏固的理論外也要實(shí)踐，看一下終究可不能夠應(yīng)用到自己實(shí)驗(yàn)當(dāng)中去。常用的包被液除了方才說(shuō)到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3.封閉：繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的進(jìn)程。封閉就是讓很多不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空地，從而排擠ELISA后的過(guò)程中攪擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價(jià)廉，能夠高濃度運(yùn)用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清(首要為了掃除類(lèi)似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。但終究選用什么，要依據(jù)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)來(lái)實(shí)踐。
4.洗刷板：能夠說(shuō)在ELISA操作中，洗刷是*首要的關(guān)鍵技術(shù)。由于聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為到達(dá)別離游離的和結(jié)合的酶符號(hào)物的意圖，鏟除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的攪擾物質(zhì)，在洗刷時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來(lái)。所以在洗板時(shí)會(huì)有必定誤差，人為要素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機(jī)在外)，洗的不*或串了孔，對(duì)如此活絡(luò)的ELISA體系但是不小的影響。
5.加抗體標(biāo)本(和二抗)：留意該換槍頭時(shí)換槍頭。標(biāo)本稀釋一般可用pbs稀釋，也可用封閉液去稀釋。如需加二抗，還要留意二抗的作業(yè)濃度，太低則上色淺。
6.顯色：顯色體系又許多，我們一開(kāi)始做的時(shí)分，要挑選適宜的顯色體系。留意顯色體系酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉。
