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寵物獸醫(yī)ELISA檢測的檢測方法有哪幾類?
  ELISA指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。
  寵物獸醫(yī)ELISA檢測基本原理:
  ①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。
 ?、谑箍乖蚩贵w與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。
 ?、墼跍y定時,把受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。
 ?、芗尤朊阜磻?yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺有無定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可很大地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。
  雙抗夾心法
  夾心法常用于檢測大分子抗原,一般的操作步驟為:
  ①將具有專一性的抗體固著于塑膠孔盤上,完成后洗去多余抗體;
  ②加入待測檢體,檢體中若含有待測的抗原,則其會與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié);
 ?、巯慈ザ嘤啻郎y檢體,加入另一種對抗原專一的一次抗體,與待測抗原進(jìn)行鍵結(jié);
  ④洗去多余未鍵結(jié)一次抗體,加入帶有酶的二次抗體,與一次抗體鍵結(jié);
 ?、菹慈ザ嘤辔存I結(jié)二次抗體,加入酶底物使酵素呈色,以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果。
  寵物獸醫(yī)ELISA檢測間接法
  間接法常用于檢測抗體,一般的操作步驟為:
 ?、賹⒁阎目乖讨谒苣z孔盤上,完成后洗去多余的抗原。
  ②加入待測檢體,檢體中若含有待測的一次抗體,則其會與塑膠孔盤上的抗原進(jìn)行專一性鍵結(jié)。
 ?、巯慈ザ嘤啻郎y檢體,加入帶有酶的二次抗體,與待測的一次抗體鍵結(jié)。
 ?、芟慈ザ嘤辔存I結(jié)二次抗體,加入酶底物使酶呈色,藉儀器(ELISA reader)測定塑膠盤中的吸光值(OD值),以評估有色終產(chǎn)物的含量即可測量待測抗體的含量。
  競爭法
  競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制,一般用于檢測小分子抗原,其操作步驟為:
 ?、賹⒕哂袑R恍缘目贵w固著于塑膠孔盤上,完成后洗去多余抗體;
 ?、诩尤氪郎y檢體,使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié);
  ③加入帶有酶的抗原,此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié),由于塑膠孔盤上固著的抗體數(shù)量有限,因此當(dāng)檢體中抗原的量越多,則帶有酶的抗原可鍵結(jié)的固著抗體就越少,亦即,兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結(jié),即所謂競爭法之由來。
 ?、芟慈z體與帶有酶的抗原,加入酶底物使酶呈色,當(dāng)檢體中抗原量越多,代表塑膠孔盤內(nèi)留下之帶有酶的抗原越少,顯色也就越淺。
  注:當(dāng)需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原,或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤上時,一般會考慮使用競爭法寵物獸醫(yī)ELISA檢測。
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