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預期用途

此酶免試劑盒用于細胞裂解液，組織，血漿和尿液中cGMP的定量檢測

 

實驗原理

此試劑盒采用的競爭酶免法，游離的cGMP和乙酰膽堿酯酶標記的cGMP共同競爭結(jié)合位點上一定量的cGMP特異性兔抗。由于標記的cGMP量不變，隨著游離的cGMP的不同，標記cGMP與兔抗結(jié)合，結(jié)合的量與孔內(nèi)游離的cGMP濃度成反比。兔抗-cGMP復合物再與預先包被在微孔板內(nèi)的鼠單抗抗兔IgG結(jié)合，洗板洗去未結(jié)合的復合物，然后加入底物顯色液，反應液有明顯的黃色并在412nm處有強吸光度值，顯色強度與結(jié)合的標記cGMP濃度成正比，而與游離的cGMP成反比。

 

試劑盒組成

 

實驗所需材料但試劑盒未提供

1.      酶標儀 405-420nm

2.      可調(diào)節(jié)的移液管和可重復使用的吸量器

3.      超純水

4.      用于樣品準備的其它器材

 

儲存條件和穩(wěn)定性

此試劑盒需按要求儲存于-20℃,并在有效期內(nèi)使用,有效期見盒外

 

實驗前準備

緩沖液制備

所有緩沖液貯存在4℃至2個月

EIA緩沖液準備

將1支EIA緩沖液（編號:400060）加90 ml超純水進行稀釋.確保沖洗掉瓶內(nèi)鹽類沉淀物.

洗滌液準備

用2L的超純水稀釋5 ml400倍濃縮的洗滌液（96T試劑盒,編號:400062）,同時加入1 ml吐溫20（編號:400035） 或者 用5L的超純水稀釋12.5 ml400倍濃縮的洗滌液（400T試劑盒,編號:400062）, 同時加入2.5 ml吐溫20（編號:400035）

提示:由于吐溫20是粘性液體,所以不能用常規(guī)的移液管移液.需用位移移液管與注射器進行定量.

 

樣品準備

一般情況下，尿液和組織上清液可用緩沖液稀釋，然后直接加入微孔內(nèi)。血漿，血清，全血和組織勻漿和其他非均勻的基質(zhì)可能會含有感染實驗的雜質(zhì)，在進行大量樣品檢測時是先進行干擾檢查。進行干擾檢測試驗時，稀釋1到2個檢測樣品，每個樣品兩個不同的稀釋比例，如果在zui后的cGMP濃度計算中兩個不同稀釋比例的樣品具有良好的相關(guān)性，則不需純化，否則需進行純化。由于多數(shù)樣品中都會含有磷酸二酯酶，樣品純化強制酶對cGMP的水解。

 

血漿（血清）純化

500ul的血漿加上2ml的冰乙醇混勻，室溫下放置5min，1500xg下離心10min以除去沉淀，將上清移至另一10ml的干凈試驗管。在真空離心機中或者氮氣氣流中干燥上清液，然后再加入500μl的EIA緩沖液溶（離心機能用來干燥提取物中的水分），確保所乙醇已經(jīng)除盡以免微量的乙醇影響檢測結(jié)果。

 

培養(yǎng)基樣品

組織和細胞上清無需純化可直接用于試驗。如果樣品中的cGMP濃度足夠高則需用緩沖液進行10倍的稀釋，試驗操作無需進行任何改動。當樣品低濃度時（樣品無需緩沖液稀釋），稀釋同一培養(yǎng)基中的標準曲線，以達到樣品和標準品基質(zhì)達到相符合。我們建議要首先建立標準曲線以確保在特殊的樣品中試驗也可進行。

細胞液抽提

1.    提出培養(yǎng)基

2.    每35cm²表面區(qū)域加入1ml的0.1M的鹽酸

3.    室溫下孵育20min

4.    用刮刀將細胞從表面刮落

5.    用移液槍吹打混勻直至上清均勻，轉(zhuǎn)移至合適的離心管內(nèi)

6.    1000xg

這些上清可直接用于試驗

 

組織樣品

7.    組織中的循環(huán)核苷酸會立即分解，所以下離心10min

1.    上清倒入另一干凈試驗管內(nèi)采樣后應將其立即冰凍

2.    冰凍組織稱量，滴加5-10個單位（液體/ml，組織/g）的TCA,用勻漿器將樣品混勻。

3.    1500xg下離心10min，去除沉淀，將上清移至另一干凈試驗管

4.    用水-飽和乙醚從樣品中抽提TCA。5體積的乙醚和1體積的上清，混合10秒，萃取分離，去除上層，重復抽提兩次以上。

5.    通過在70℃下加熱樣品以除去剩余的乙醚。

組織中提取的上清無需稀釋可直接用于試驗，標準曲線基質(zhì)液的準備，抽提10ml 用乙醚處理過的5%的TCA，通過加熱除去剩余的乙醚，剩下的溶液檢測得標準曲線。

 

特異性試劑的制備

cGMP  AChE示蹤液

100dtn cGMP  AChE示蹤液與6ml的緩沖液

或500 dtn cGMP  AChE示蹤液與30ml的緩沖液

配制的cGMP示蹤液應儲存在4℃下，4周內(nèi)有效

示蹤染料：加入染料可輔助目測觀察，在配制好的示蹤液中加入染料（60ul的染料加入到6ml的示蹤液中或是300ul染料和30ml的示蹤液）

cGMP抗血清

100dtn cGMP抗血清與6ml的緩沖液

或500 dtn cGMP抗血清與30ml的緩沖液

配制的cGMP抗血清應儲存在4℃下，4周內(nèi)有效

抗血清染料：加入染料可輔助目測觀察，在配制好的抗血清中加入染料（60ul的染料加入到6ml的抗血清中或是300ul染料和30ml的抗血清）

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